ANCA sú autoprotilátky proti antigénom cytoplazmatických granúl neutrofilných granulocytov. ANCA autoprotilátky sa vyskytujú pri vaskulitídach, glomerulonefritídach, imunokomplexových ochoreniach, zápalových črevných ochoreniach a u iných autoimunitných ochoreniach. Rozlišujeme p-ANCA (perinukleárné), c-ANCA cytoplazmatické), aANCA alebo xANCA (atypické) a GS-ANCA (granulocytové špecifické). Hlavným antigénom c-ANCA je proteináza 3 (PR3), ktorá je prítomná v primárnych granulách neutrofilov. Prítomnosť protilátok proti PR3 je dôležitým laboratórnym markerom pre Wegenerovu granulomatózu, ich hladina kolíše v závislosti na stupni postihnutia a aktivite choroby (u 30 – 40 % pacientov v remisii a u 70 – 80 % pacientov v aktívnom štádiu). Pri p-ANCA je hlavným antigénom enzým myeloperoxidáza (MPO). Protilátky proti MPO sú u pacientov s rôznými typmi glomerulonefritíd (nekrotizujúca glomerulonefritída, progredujúca glomerulonefritída), pri non-Wegenerovej granulomatóznej vaskulitíde a Goodpastureovým syndrómom. Tieto protilátky sú prítomné aj pri ďalších autoimunitných ochoreniach, napr. reumatoidná artritída, mikroskopická polyangiitída, systémový lupus erythematosus. V tabuľke sú prehľadne znázornené ANCA protilátky a ich vzory farbenia pri nepriamej imunofluorescencií s použitím rôznych fixatív.
| Typ protilátky | Etanolom fixované neutrofily | Formalínom fixované neutrofily | Hep-2 |
|---|---|---|---|
| c-ANCA | Cytoplazma | Zrnitý/Cytoplazma | Negatívne |
| pANCA | Nuklear/Perinuklear | Zrnitý/Cytoplazma | Negatívne |
| GS-ANCA | Nuklear/Perinuklear | Znížené/žiadne | Negatívne |
| atypická ANCA | Cytoplazma/Perinuklear | Cytoplazma/žiadne | Negatívne |
| pANCA + ANA | Nuklear/Perinuklear | Cytoplazmatické/znížené | Jadrové |
| ANA | Nuklear/Perinuklear | Znížené/žiadne | Jadrové |
Zhrnutie
Antineutrofilné cytoplazmatické protilátky označované ako ANCA majú veľký klinický význam pri posudzovaní pacientov s cievnymi poruchami. Ktoré nielenže poskytujú diagnostickú klasifikáciu ale taktiež pomáhajú pri monitorovaní ochorenia. Ľudský preparát neutrofiloy je najbežnejším substrátom na detekciu a popis ANCA protilátok, avšak v ostatnom období narastá skríning metódou EIA za použitia špecifických antigénov. Zatiaľ čo je jasná spojitosť medzi protilátkami proteináza 3 a Wegenerovou granulomatózou, napríklad priamy dôkaz patogenity stále chýba.
Antigény a protilátky
V roku 1982 opísal Davies a kolektív prítomnosť protilátok ANCA triedy IgG v sére pacientov s nekrotizujúcou glomeruonefritídou. V roku 1985 nasledovala publikácia van de Woude a kolektívu, ktorí zistili že 25 z 27 pacientov s aktívnou Wegenerovou granulomatózou vykazujú typické cytoplazmatické farbenie (cANCA) pri metóde nepriamej imunofluorescencie. Perinukleárna ANCA (pANCA) bola opísaná v roku 1988 Falkom a kolektívom v obličke pacientov so systémovým zápalom. Význam týchto protilátok pri rôznych typoch vaskulitíd je v dnešnej dobe dobre preskúmaný. ANCA sú primárnym znakom niektorých ochorení ako Wegenerova granulomatóza, polyarteritída nodosa, Churg straussovej syndróm, idiopatická Pauci-imunitná fokálna a segmentálna nekrotizujúca glomerulonefritída a sekundárnym znakom ochorení reumatoidná artritída a systémový lupus erythematosus. Efektívna liečba závisí od včasného rozpoznania týchto ochorení a preto je dôležité pri podozrení na niektorú so spomínaných ochorení otestovať pacientov na prítomnosť ANCA protilátok.
Neutrofily používané pre imunofluorescenciu
Dnes sú dostupné štandardizované a stabilné preparáty neutrofilov ale aj tak si väčšina laboratórií pripravuje svoje vlastné. Značnú pozornosť je potrebné venovať štandardizácií medzi laboratóriami prostredníctvom externých kontrol kvality, ktoré sú nevyhnutnou súčasťou laboratórnych procesov. Preparáty ľudských neutrofilov sa pripravujú z celej krvi pomocou konfigurácie s gradientom hustoty. Neutrofily sú následne dávkované na sklíčko, nechajú sa usadiť po dobu niekoľko minút, sušia sa a fixujú v etanole alebo formalíne a kladie sa dôraz na to, aby nedošlo k ich aktivácií. Výsledný preparát by mal ukázať oddelené, jednotné bunky s kruhovými obrysmi a minimálnymi depozitmi na pozadí. Avšak aj napriet tomu v preparáte bude malé percento ďalších leukocytov, ktoré môžu vykazovať slabú fluorescenciu. Je dôležité, aby neutrofily neboli aktivované, pretože to môže viesť k mätúcim alebo abnormálnym vzorom farbenia.
Triedy protilátok
ANCA protilátky sú prevažne triedy IgG, takže sa na ich značenie používa FITC konjugát anti-ľudský IgGFc. ANCA protilátky však existujú aj v iných triedach, v triede IgA pri Henoch-Schönlein purpureaa v triede IgM pri vaskulitídach so závažným pľúcnym krvácaním.
Proteináza 3 protilátky (cANCA)
Antigény
Proteináza 3 (PR3) je 29kDa serínová proteáza nachádzajúca sa v azurofilných granulách neutrofilov a v peroxidáza-pozitívnych lyzozómoch monocytov. PR3 má neproteolytickú antimikrobiálnu aktivitu voči baktériám a hubám. Keď sa uvoľní pri zápalových stavoch, PR3 môže degradovať kolagény, proteoglykány, elastín a ďalšie komponenty spojivového tkaniva všetkých štyroch podtried IgG.
Detekčné metódy
Etanolom fixované neutrofily nám odkrývajú typické cANCA vzory cytoplazmatickej granulárnej fluorescencie s centrálnym interlobulárnym zdôraznením. Pri formalínom fixovaných neutrofiloch je fluorescencia stále cytoplazmatická a granulárna ale s menším interlobulárnym zvýraznením. Všetky pozitívne vzorky by mali byť potvrdené EIA testom.
Klinická relevancia
Anti-PR3 protilátky sú detegované u pacientov s nasledujúcimi ochoreniami: Wegenerova granulomatóza (~90%), mikroskopická polyangiitida (~50%), Churg straussovej syndróm (~30%), Pauci-imunitná fokálna a segmentálna nekrotizujúca glomerulonefritída (NCGN), systémová skleróza (~20%), akútna reaktívna artritída (~4%), chronická reaktívna artritída (~2%), ulceratívna kolitída (~17%) a reumatidná artritída (~17%). Pri Wegenerovej granulomatóza (WG) pozitívny pacienti na PR3 sú náchylnejší na relaps a môžu mať rapídne progresívnejšie renálne zlyhanie.
Indikácia
Pri podozrení na jedno s nasledujúcich ochorení: Wegenerova granulomatóza, mikroskopická polyangiitida, Churg straussovej syndróm, Pauci-imunitná fokálna a segmentálna nekrotizujúca glomerulonefritída (NCGN), systémová skleróza, akútna reaktívna artritída, chronická reaktívna artritída, ulceratívna kolitída a reumatidná artritída.
Myeloperoxidáza protilátky (pANCA)
Antigény
Cieľovým antigénom anti-MPO protilátok je myeloperoxidáza, 14kDa kovalentne viazaný dimér v pozitívne nabitých azurofilých granách neutrofylov a lyzozómov monocytov. Myeloperoxidáza v kombinácií s H2O2 katalyzuje oxidáxciu chloridových iónov na kyselinu chlórnu. Kyselina chlórna má schopnosť zabíjať fagocytujúce baktérie a vírusy a v kombinácií s metabolitmi, inaktivuje inhibítora proteázy ako α-anti-trypsín v krvi a tkanivách.
Detekčné metódy
Imunofluorescencia na neutrofiloch fixovaných etanolom ukazuje typické pANCA vzory s perinukleárnou fluorescenciou a predĺžením jadra. Avšak vzorky obsahujúce anti-MPO, anti-MPO a ANA alebo ANA môžu pri etanolom fixovaných neutrofiloch vyzerať podobne. Je možné odlíšiť medzi skutočnými anti-MPO a ANA vzorkami tak, že použijeme neutrofily fixované vo formalíne alebo HEp-2 bunky. Pri fixácií formalínom dochádza k denaturácií väčšiny jadrových antigénov a z toho dôvodu sú ANA protilátky slabšie alebo negatívne. Pri anti-MPO protilátkach fixovaných vo formalíne pozorujeme cytoplazmatické granulárne fluorescenčné farbenie. Všetky pozitívne vzorky by mali byť potvrdené metódou EIA.
Klinická relevancia
Anti-MPO protilátky sú detegované u pacientov s nasledujúcimi ochoreniami: Wegenerova granulomatóza (~15%), mikroskopická polyangiitida (~50%), Churg straussovej syndróm (~40%), idiopatická Pauci-imunitná fokálna a segmentálna nekrotizujúca glomerulonefritída (~80%), renálna rýchlo progredujúca glomerulonefritída (~50%), polyarteritída nodosa (~62%), systémová skleróza (~18%), chronická reaktívna artritída (~8%), ulceratívna kolitída (~10%) a reumatoidná artritída (~47%) a taktiež v nižšej frekvencií pri anti-GBM (bazálne membrány glomerulov), systémovom lupuse erythematosus, IgA nefropatií a liekami indukovanej glomerulonefritíde. Anti-MPO pozitívni pacienti sú zvyčajne starší ako pacienti s anti-PR-3 pozitívnymi pacientmi a titre protilátok MPO často pretrvávajú aj počas remisie ochorenia. Anti-MPO pacienti sú menej náchylní na relaps a majú menej progresívny typ glomerulonefritídy.
Indikácia
Vykonanie testu na autoprotiláty proti myeloperoxidáze doporučujeme pri podozrení na jedno z nasledujúcich ochorení: Wegenerova granulomatóza, mikroskopická polyangiitida, Churg straussovej syndróm, idiopatická Pauci-imunitná fokálna a segmentálna nekrotizujúca glomerulonefritída, renálna rýchlo progredujúca glomerulonefritída, polyarteritída nodosa, systémová skleróza, chronická reaktívna artritída, ulceratívna kolitída a reumatidná artritída.
Literatúra
- RADICE, A – SINICO RA. Antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA). PubMed. 2014. Dostupné na internete.
- SEO, P. – STONE, JH. The Antineutrophil Cytoplasmic Antibody - Associated Vasculitides. The American Journal of Medicine. Volume 117, Issue 1, 2004. s 39-50.
- HUGES, RG. – SURMACZ, MJ. – KARIM, AR. et al. 2008. Atlas of Tissue Autoantibodies. Third Edition. United Kingdom: The Binding Site Ltd., 2008. 220 s. ISBN 9780704427013.
- BRADWELL, AR. – STOKES, RP. – JOHNSON, GD. 1997. Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues. England: AR Bradwell, 1997. 103 s. ISBN 0704417790.
- BRADWELL, AR. – STOKES, RP. – MEAD GP. 1999. Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. England: AR Bradwell, 1999. 112 s. ISBN 0704485109.
- SHOENFELD, Y. – GERSHWIN, ME. – MERONI, PL. 2007. Autoantibodies. Second Edition. Italy: Elsevier, 2007. 862s. ISBN: 978-0-444-52763-9.
- HRDÁ, P. – ŠTERZL, I. 2003. Vyšetření autoprotilátek – současné možnosti. In interní medicína pro praxi. ISSN 1212-7299, 2003, vol. 8, p. 410-413.